Takara是一家總部位于日本京都的生物醫(yī)藥企業(yè)，起源于1841年，正式創(chuàng)立于1925年。該公司主要從事研究試劑、科學(xué)儀器、保健食品以及基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品（CDMO）的研發(fā)和銷(xiāo)售。

對(duì)于生命科學(xué)工作者來(lái)說(shuō)，Takara應(yīng)該不陌生，其提供的限制性?xún)?nèi)切酶和聚合酶是實(shí)驗(yàn)室中常用試劑。Takara也是世界上shou批提供生命科學(xué)科研用試劑以及商用PCR儀器和試劑的企業(yè)。

TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒是一種將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的專(zhuān)用試劑。RNA的純度可以影響cDNA的合成量，而制備RNA的關(guān)鍵就是要抑制細(xì)胞中的RNA裂解酶，并防止所用儀器和試劑中RNA裂解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；在操作過(guò)程中避免講話(huà)等等。通過(guò)以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。制品中附加了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作用稀釋液EASY Dilution(for Real Time PCR)將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時(shí)也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋?zhuān)菀自趯拸V范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

提取的Total RNA中常?；煊谢蚪MDNA，而基因組DNA可以直接作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，造成解析結(jié)果不準(zhǔn)確。為了避免這種情況發(fā)生，我們必須采取如下兩種措施：1、引物設(shè)計(jì)時(shí)避免基因組DNA擴(kuò)增；2、使用DNase I處理除去基因組DNA。

1、引物設(shè)計(jì)時(shí)避免基因組DNA擴(kuò)增

我們可以利用基因組DNA具有外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，在引物設(shè)計(jì)上下工夫，使PCR反應(yīng)時(shí)不能擴(kuò)增基因組DNA。此時(shí)我們首先應(yīng)確認(rèn)目的基因的基因組結(jié)構(gòu)，選擇較長(zhǎng)的內(nèi)含子。然后，在這個(gè)內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子上分別設(shè)計(jì)上、下游引物。Real Time PCR反應(yīng)時(shí)通常擴(kuò)增的目的DNA片段長(zhǎng)度都比較短設(shè)置的條件也是適合短片段DNA的擴(kuò)增，超過(guò)500bp就很難擴(kuò)增了。所以，當(dāng)內(nèi)含子足夠長(zhǎng)時(shí)，基因組DNA來(lái)源的擴(kuò)增就不能發(fā)生：當(dāng)內(nèi)含子較短時(shí)，基因組DNA來(lái)源的擴(kuò)增可能發(fā)生，但基因組DNA來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物比mRNA來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)，可通過(guò)分析融解曲線(xiàn)的方法加以區(qū)分。但是，此種方法不適合具有單個(gè)外顯子的基因、或者不具有內(nèi)含子的生物種以及基因組情報(bào)沒(méi)被解析的生物種等，此時(shí)必須采取方法2解決。

2、使用DNase I處理除去基因組DNA

使用常規(guī)方法提取Total RNA后，再使用DNase I分解混入的基因組DNA，最后進(jìn)行苯酚/氯仿抽提乙醇沉淀等純化Total RNA。

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